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?#31243;?#32858;合酶链反应(PCR)技术及发展

时间:2018-03-01 来源:夸克官方

 PCR技术是由美国生物化学家凯利·穆利斯在1983年发明的,之后在1993年10月,他因这项发明获得了诺贝尔化学奖的殊荣。是?#36125;?#20998;子生物学最重要的发明之一。PCR采用了利用一种人工方法和反复相同程序,并利用一种特殊的酶——即DNA聚合酶来扩增特定的DNA片段。从而使DNA的复制能够在细胞外得以实现。
    PCR用于扩增一小?#25105;?#30693;的DNA片断,可能是单个基因,或者仅仅是某个基因的一部分。与生物细胞中自然发生的DNA复制不同的是,通过使用PCR技术我们可以人为控制所复制的DNA片段,然而它只能复制很短的DNA片断,通常不超过10kbp(千碱基对)。某些特定的方法可以扩增40kbp左?#19994;?#29255;断,但是这种大小与真核细胞的染色体DNA相比仍然是很少的。例如,人的体细胞DNA含有大约30亿个碱基对。 目前应用的PCR反应需要几个基本组成:DNA模板(template),含有需要扩增的DNA片断;一对引物(primer),人工合成的单链DNA,引物与所要扩增的DNA片断的起始和终止区域完全互补。在“黏合”时引物结合于DNA模板的起始和终止点,DNA聚合酶结?#31995;?#36825;两个位置,开始合成新的DNA链;DNA聚合酶(polymerase),复制需要扩增的区域;脱氧单核苷酸(dNTP),DNA分子的最基本组件;缓冲体系,提供适合聚合?#24863;?#20351;功能的化学环境。
  DNA聚合酶天然存在于生物体内,在细胞分裂前进行DNA的复制。当DNA开始复制时,解旋酶将双股的DNA分开成两个单股。DNA聚合酶便结合在两DNA单股链上,生成互补链。然而在体外实验中解旋酶无法正常作用,只能通过把双链DNA加热到96℃来使得双链分离成为两条单链。在这个温度下,DNA聚合酶就会失活,因此在每个循环的加热步骤后必须补充新的聚合酶。穆利斯的原始PCR反应需要大量时间和DNA聚合酶,并且在整个PCR反应中都需要人来照看。后来,由?#28909;?#32454;菌水生栖?#26579;?#20307;内产生的DNA聚合酶改善了这种低效的PCR反应。这种?#28909;?#32454;菌生活在温度达到50至80℃的温泉中,因此它的DNA聚合酶具有耐热性。在用于PCR反应时,并不会因为高温而失活,所以不需要不断加入新的聚合酶,PCR反应由此变得简单并且可以由机器操作。最初的具有耐热性的DNA聚合酶被称为Taq,因为提取于水生栖?#26579;?Thermus aquaticus)。Taq酶?#20004;?#20173;被被广泛用于当前的PCR操作中。然而Taq酶的缺点是它缺少3'->5'校正外切酶活性,因此在复制DNA时有时会出错,造成DNA序列突变,这使得它并不适合DNA的测序与生物克隆工作。从海底火山附近的古菌中获得的Pwo和Pfu等酶均有校正机制,能够大大降低PCR反应中的突变。现在市场?#31995;腜CR试剂盒中常常把taq酶与其他高精密度聚合酶组合使用,来确保PCR的反应效率和准确性。
        PCR 的基本过程类似于DNA 的天然复制, 过程被称为热循环,特异性依赖于与?#34892;?#21015;两端互补的寡核昔酸引物。整个过程由变性-退火-?#30001;?#19977;个基本反应步骤构成:①模板DNA 变性:模板或经PCR 扩增形成的DNA经加热至94℃左右一定时间后,双链之间氢键断裂,双股螺旋解链,变成两条单链,以便它与引物结合,为下轮反应做准备。?模板DNA与引物的退火(复性):DNA加热变性成单链后,当温度降至一定程度(55℃左右)时,引物即与模板DNA单链的互补序列配对结合,该步骤时间1-2分钟。新技术的融合型核酸聚合酶在此阶段的温?#28982;?#39640;于熔点3~5℃,仅需时间5~10秒。?引物的?#30001;歟?#22312;Taq DNA聚合酶的作用下,DNA模板?#31995;?#24341;物以dNTP为原料,按A-T、C-G碱基配对与半保留复制原则,合成一条新的与模板DNA链互补的链。重复上述变性-退火-?#30001;?#30340;循环过程,每一循环获得的“半保留复制链”都可成为下次循环的模板。通常,整个过程一般可持续20至40个循环,?#23458;?#25104;一个循环需时2-4min,2-3h就能将靶核酸扩增放大几百万倍。
        如今PCR这项技术,被广泛地运用在医学和生物学的实验室,例如克隆、考古、建立遗传图谱、诊断传染病、基因复制以及亲子鉴定。同时?#23521;?#29983;出了各种变体,如逆转录PCR和实时PCR?#21462;?#29616;代医学研究证明,人类疾病多数是直接或间接与基因有关,如肿瘤、糖尿病和心血管疾病?#21462;?#36890;过使用PCR技术,我们不仅可以有效地分析病因,也可以在临床症状出现之前预测病人发病?#30446;?#33021;性,从而提前预防。这对有遗传病史家庭的成员十分有帮助。对于微生物感染引发的疾病(细菌,病毒,真菌,寄生虫等),PCR的应用也十分广泛。完成一次对病理样本的检测只需3至4小时,?#23545;?#24555;于传统的检测方法。由于引物的设计是针对于病原体核酸的特征序列的,所以不会发生误诊。
        在医学实验诊断中我们经历了生化和免疫诊断的发展过程,由于各类扩增技术的出现使我们进入了基因诊断的新时代并成就了现代意义基因诊断的崛起。这将改变以往对疾病的表型认识和表型诊断,从本质上认?#37117;?#30149;和诊断疾病。在各类扩增技术中, PCR 的地位尤为突出。目前,全世界利用 PCR 技术诊断感染?#32422;?#30149;每年达几千万人次,其费用早已大幅下降,说明 PCR 有着巨大的潜在市场。美国临床检验标准化委员会于 1995 年颁?#21058;?#20851;于感染?#32422;?#30149;分子诊断应用?#27573;А?#26465;件和质量控制细则等准则文件。而国际临床化学学会于 1998 年又发?#21058;?#20851;于分子扩增在临床诊断中应用的质?#31185;?#20272;基础的文件并对 PCR 操作的各个?#26041;?#36827;行了详细论述。两个权威性文件也都肯定了 PCR 技术在医学检验方面的重要性。基因诊断可能将是以后的发展方向并作为疾病的常规诊断技术。 
        夸克公司自2000年以来致力于核酸类产品的研发,并于2005成功开发出《乙型肝炎病毒核酸荧光定量检测及YMDD变异检测试剂?#23567;?#24182;获取国家食品药品监督局审批注册证书,当时被评为国家二类新药。该产品采用了乙型肝炎病毒特异引物,利用核酸扩增、荧光标记探针,结合taqman MGB双探针技术,对人血清及血浆中乙型肝炎病毒(HBV DNA)定量检测,同时对YMDD M位点变异进行检测。可用于临床对乙型肝炎的辅助诊断和抗病毒药物的疗效观察。该产品特点具有以下特点:一、单管双检同一次反应,可同时测出HBV DNA载量及YMDD变异情况,为医?#33322;?#32422;试剂成本及时间;二、?#23637;?#26816;测  直接在反应管中对PCR扩增产物进行荧光数据采集和分析,不需开盖检测,不需要扩增后处理;三、结果判断简捷、明确  通过双色荧光通道检测所得Ct值可直接分辨出是否发生YMDD变异,可适用于ABI系?#23567;ightcycler480、iCycler等多通道PCR仪。
                                                                              技术部    周 静 

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